Determinazione AB0 diretta

Determinazione AB0 diretta

Mette in evidenza la presenza degli antigeni A e B sui globuli rossi da tipizzare attraverso una reazione di agglutinazione. E’ il metodo base e più semplice, può essere eseguito in urgenza anche su poche gocce di sangue capillare ottenuto da puntura digitale o del lobo dell’orecchio.(....)


Reagenti:
· antisieri Anti A e Anti B commerciali [1] (da conservare in frigo 2-6°C)

Campione:
· sangue da tipizzare: anticoagulato (in provetta con citrato o EDTA: è il materiale preferibile) o capillare fresco (prima che coaguli) o da coagulo di sangue intero[2]

Sono possibili 2 metodiche in alternativa:

·Su piastra bianca o su vetrino:
> deporre sulla piastra 1 goccia di sangue non diluito + 1-2 gocce di antisiero
> mescolare con una barretta di plastica o di vetro pulita
> attendere 30-60 secondi basculando la piastra (od il vetrino)
> verificare l’eventuale agglutinazione.

·In provetta:
> mettere in una provetta 1 goccia di sospensione di emazie al 3-5% in soluzione fisiologica[3] + 1-2 gocce di antisiero
> centrifugare a bassi giri (1000 x g circa) per 30 secondi
> risospendere il fondello con colpetti leggeri e rotazione della provetta – tip and roll –per evidenziare l’eventuale agglutinazione.

Interpretazione:

§ agglutinazione = presenza dell’antigene
§ non agglutinazione = assenza dell’antigene

Esempio:
· Anti A + sangue = agglutinazione
· Anti B + sangue = non agglutinazione
· Interpretazione : gruppo A

Gli antisieri oggi in commercio sono in genere costituiti da anticorpi monoclonali, estremamente attivi, specifici e stabili anche in condizioni di conservazione non ottimale. La reazione di agglutinazione attesa con questi antisieri commerciali è evidente ad occhio nudo e non necessita il ricorso all’esame microscopico.

Raramente sono possibili dei falsi positivi[4], cioè delle reazioni di agglutinazione vera o apparente a cui non corrisponda la presenza dell’antigene, in questo caso A o B. La tecnica in provetta con emazie diluite riduce i falsi positivi ed i risultati dubbi.
E’ opportuno eseguire regolari controlli di qualità degli antisieri con emazie note (A, B, e 0) e soprattutto è fondamentale conservare gli antisieri in un frigorifero funzionante e controllato e verificarne periodicamente la validità.
Da un punto di vista puramente culturale ricordiamo l’esistenza di rarissimi sottogruppi A e B che possono dare false o dubbie positività alla prova diretta.

[1] Si può anche utilizzare l’antisiero anti-A,B , che agglutina sia emazie A che B. Questo serve da conferma alle reazioni osservate con l’ anti-A e l’ anti-B. Oggi con gli antisieri monoclonali, più sensibili e specifici di quelli policlonali umani utilizzati in passato, l’utilizzo dell’antisiero anti-A,B non è più indispensabile.[2] E’ possibile utilizzare anche sangue coagulato per la determinazione del gruppo. Dopo la retrazione del coagulo le emazie intrappolate nel coagulo possono essere liberate e risospese nel siero rompendo i tralci di fibrina con una pipetta Pasteur.[3] Per preparare una sospensione di emazie al 3-5% miscelare una goccia di sangue intero in 15 gocce di soluzione fisiologica od una goccia di emazie concentrate in 30 di soluzione fisiologica. [4] Falsi positivi alla determinazione diretta: ciò può avvenire a causa di impilamenti delle emazie (da distinguere dalla agglutinazione), o si possono osservare vere agglutinazioni causate da auto-anticorpi presenti nel plasma sangue da tipizzare, anticorpi che agiscono a temperatura ambiente (detti “freddi”). In entrambi i casi si tratta di fattori presenti nel plasma del sangue da determinare e si osservano sopratutto nel caso della tecnica su piastra. Nella tecnica in provetta il plasma è molto diluito, pertanto la possibilità di queste false positività viene ridotta in provetta inoltre il risultato è più chiaramente interpretabile. Pertanto, laddove possibile, la tecnica in provetta è preferibile.
In ogni caso per escludere false positivita alla prova indiretta, in particolare se il sangue agglutina con tutti gli antisieri disponibili (in caso di gruppo AB + diffidare!!), è opportuno eseguire un autocontrollo .