1. Fattori che le influenzano la agglutinazione: la fase si sensibilizzazione

Poichè le reazioni di agglutinazione e la loro interpretazione restano la metodica fondamentale in immunoematologia è importante soffermarsi e capirne principi, limiti e soprattutto gli elementi biologici e chimico-fisici che entrano in gioco nella reazione. (...)
Nella grande maggioranza dei casi i metodi standardizzati e routinari che utilizzano i test di agglutinazione offrono risposte univoche e chiare. Quando però ci si trova di fronte a quadri dubbi o incongruenti è necessario mettere in atto e conoscere le metodiche analitiche complementari in grado di eliminare le eventuali interferenze o di potenziare la reazione antigene-anticorpo in modo da dare un esito chiaro.
La reazione di agglutinazione avviene in due fasi distinte: la sensibilizzazione e la agglutinazione vera e propria. E’ importante conoscere gli eventi ed i fattori in gioco in ciascuna delle due fasi in quanto sono diversi ed a volte addirittura antagonisti.

Fattori che intervengono nella fase di Sensibilizzazione
La sensibilizzazione consiste nel legame tra antigene ed anticorpo (Ag-Ac) ove gli antigeni in immunoematologia sono rappresentati dai gruppi sanguigni presenti sulla membrana del globulo rosso. Quello tra antigene ed anticorpo è un legame reversibile ed è tenuto insieme da forze diverse tra cui legami ionici, legami idrofobici, legami idrogeno (esotermici: aumentano cioè col diminuire della temperatura) ed in fine le forze di Van der Waals che agiscono solo quando la distanza tra le molecole è estremamente ridotta. Per le proprietà dettagliate di questi legami rimandiamo ad un testo di chimica, quello che ci interessa ora sottolineare è la varietà delle forze in gioco che possono condizionare un determinato evento quale la reazione antigene anticorpo.
La velocità della reazione quindi è finzione della concentrazione dei reagenti e del loro prodotto. La costante di equilibrio – K° - è specifica del tipo di reazione di ciascuna coppia Ag-Ac e riflette la “affinità” dell’anticorpo stresso. La costante K° è a sua volta influenzata dalla temperatura, dal pH e dalla forza ionica del mezzo dove sono in soluzione antigeni ed anticorpi.
Il legame finale Ag-Ac in virtù di queste interazioni complesse è influenzato da una serie di fattori che è importante conoscere e sono:

il pH: poiché sia le immunoglobuline che le superfici dei globuli rossi sono ricoperti da cariche elettrostatiche la concentrazione degli ioni idrogeno (pH) influenza lo stato di ionizzazione e quindi la forza delle cariche presenti. Il plasma ed il siero sono però ottimi tamponi e l’effetto di variazione del pH nell’ampio intervallo tra 5.5 e 8.5 è modesto per gran parte degli antigeni. [1]

La affinità: è determinata dal grado di “complementarietà” spaziale e chimica tra Ag e Ac. I legami tra antigene ed anticorpo sono relativamente deboli rispetto ai legami covalenti e le forze in gioco sono attive solo a brevissima distanza.

La Temperatura: la temperatura di reazione ottimale dipende dalle caratteristiche dell’antigene: le IgG sono più spesso dirette contro antigeni proteici (es: gli antigeni del gruppo Rh) per i quali i legami idrofobici- endotermici- prevalgono. Per questo motivo le IgG spesso reagiscono meglio a 37°C e sono impropriamente chiamate anticorpi caldi. Le IgM sono invece più spesso dirette contro antigeni composti da carboidrati con i quali formano soprattutto legami idrogeno dando luogo ad una reazione esotermica: per questo il legame è più forte a basse temperature, tipicamente tra i 4 ed i 25°C.

Tempo di incubazione ottimale: l’equilibrio è raggiunto dopo un determinato tempo di incubazione che non è bene però superare di molto. Per le reazioni che avvengono con emazie sospese in soluzione salina gli anticorpi di classe IgG raggiungono il livello di equilibrio, e quindi il livello di legame massimo ai corrispettivi antigeni, mediamente in 30-60 minuti a 37°C. Utilizzando soluzioni a bassa forza ionica (LISS) il tempo di incubazione può essere ridotto a 10-15 min. Per gli anticorpi anti-eritrocitari di classe IgM (es. anti-A , anti-I, anti-M) il legame a può essere quasi immediato anche a temperatura ambiente.

Forza ionica: è data dalla concentrazione degli ioni liberi in soluzione. Gli ioni liberi, quali il sodio ed il cloro, hanno la capacità di neutralizzare in parte le cariche elettrostatiche che contribuiscono al legame antigene anticorpo. Nella soluzione fisiologica (0.9% NaCl) la forza ionica è di 0.15 moli/L. Con la diminuzione della concentrazione di Sali e quindi della forza ionica aumenta progressivamente il tasso di legame Ag-Ac. Per questo motivo in immunoematologia si utilizzano spesso soluzioni a bassa forza ionica LISS (low ionic strengh solutions) da 0.03 mmoli/L per accelerare la reazione antigene anticorpo. N.B. con un eccessiva diminuzione di ioni in soluzione si favorisce la adesione aspecifica degli anticorpi e del complemento, questi ultimi a loro volta possono diminuire la carica superficiale delle emazie provocando una aggregazione aspecifica indistinguibile dalla agglutinazione vera.

Accessibilità dell’antigene: alcuni antigeni sono molto accessibili ed esposti sulla superficie del globulo rosso , es gli antigeni di gruppo ABO, mentre altri sono nascosti in cripte della membrana. Alcuni antigeni normalmente poco accessibili possono essere messi in evidenza con trattamenti particolari.

Le proporzioni tra antigene e anticorpo: un rapporto ottimale tra antigene ad anticorpo viene ottenuta nel test in tubetto mescolando due parti di siero ( o plasma) ed una parte di sospensione di globuli rossi al 2-5%. Tipicamente le “parti” in causa sono costituite da una goccia o 50 microlitri circa di sospensione/siero. Se l’anticorpo reagisce debolmente è possibile aumentare la quota di siero a 10-20 volte per aumentare la sensibilità del test. Nei test in micro colonna di gel le proporzioni e le concentrazioni delle sospensioni sono indicate nelle istruzioni operative variano a seconda del kit commerciale essendo ottimizzate dalle ditte produttrici.

Aggiunta di sostanze “potenzianti”: La reazione antigene anticorpo può essere influenzata dalla aggiunta in soluzione di sostanze quale il Glicole polietilenico - PEG – che agisce sottraendo molecole di acqua nel diluente facilitando l’avvicinamento dell’antigene con l’anticorpo. Dopo la fase di sensibilizzazione però il PEG deve essere rimosso mediante lavaggio dei globuli rossi [2]: infatti il PEG può provocare una agglutinazione aspecifica specie dopo centrifugazione spinta.

[1] Nella pratica immunoematologia solo gli anticorpi anti-M vengono potenziati acidificando il siero in causa.
[2] Per lavaggio si intende la sospensione dei globuli rossi in soluzione fisiologica e la successiva centrifugazione e rimozione del liquido supernatante. L’operazione deve essere ripetuta 3-5 volte