L’agglutinazione indiretta: test dell’antiglobulina (test di Coombs’ indiretto)

L’agglutinazione indiretta: test dell’antiglobulina (test di Coombs’ indiretto)

Per mettere in evidenza la presenza di anticorpi irregolari diretti contro le emazie del donatore si esegue la prova crociata in fase antiglobulinica dopo incubazione a 37°C (test di Coombs indiretto). Lo scopo di questo test è mettere in evidenza gli anticorpi anti-eritrocitari di classe IgG, che sono i più frequenti tra gli anticorpi “irregolari” ed anche quelli più spesso clinicamente significativi.(....)

Il test prevede una fase di incubazione a 37°C perché è questa temperatura ottimale alla quale gli anticorpi IgG si legano ai globuli rossi. Gli anticorpi irregolari infatti sono generalmente della classe IgG, a differenza degli anticorpi regolari anti-A ed anti –B che sono prevalentemente IgM ed attivi anche a temperatura ambiente. Per mettere in evidenza le IgG le emazie del donatore devono essere quindi incubate con il siero/plasma del ricevente a bagnomaria a 37° per un tempo sufficiente (45-60 minuti con emazie sospese in soluzione fisiologica).
Le IgG non sono però di norma in grado di dare una agglutinazione diretta e visibile delle emazie. Per mettere in evidenza gli anticorpi di classe IgG eventualmente adesi ai globuli rossi è quindi necessario utilizzare un antisiero anti-IgG umane (siero antiglobulina o siero di Coombs) che, creando dei ponti tra gli anticorpi adesi, provoca una agglutinazione evidente anche dei globuli rossi.

Per l'esecuzione del test di Coombs indiretto, oltre a quanto già utilizzato per la esecuzione dei test di agglutinazione diretta sono necessari:

· siero antiglobulina o siero di Coombs(anticorpi anti IgG ed -in genere- anti-Complemento)
· soluzione fisiologica ( o soluzione a bassa forza ionica)
· bagno termostatato a 37°C
· centrifuga a bassi giri
Per verificare la attività effettiva del siero di Coombs è opportuno avere delle emazie sensibilizzate (coperte da IgG) come controllo positivo[1] .

La metodica del test di Coombs indiretto – TCI – in tubetto può essere riassunta come segue:

· Mettere in una provetta una goccia di sospensione al 3-4% di emazie del donatore in soluzione fisiologica con 4 goccie di siero o plasma del ricevente.
( se non già fatto in precedenza è utile in questa fase centrifugare la miscela per verificare la presenza/assenza di agglutinazione diretta a T° ambiente da parte di eventuali IgM dirette contro antigeni eritrocitari)
· Incubare la provetta a bagnomaria a 37° per 45-60 minuti[2].
· Lavare le emazie per 3-4 volte. Il lavaggio si ottiene sospendendo delle emazie in 4-5 cc di soluzione fisiologica > centrifugare a bassi giri – 1000 x g per 60 secondi > eliminare il sopranatante senza sospendere il fondello di emazie.
I lavaggi servono ad eliminare le immunoglobuline libere nel plasma che altrimenti inattiverebbero il siero di Coombs.
· Al fondello di emazie dell’ultimo lavaggio si aggiungono 2 goccie di siero di Coombs e si risospendono le emazie.
· Si centrifuga la provetta a bassi giri- 1000 x g - per 30 secondi.
· Si scuote gentilmente la provetta – tip and roll - per rilevare una eventuale agglutinazione del fondello di emazie. In caso di assenza di agglutinazione macroscopica una goccia di sospensione deve essere esaminata al microscopio a piccolo ingrandimento per rilevare micro-agglutinati.

Interpretazione:

Presenza di agglutinazione (anche solo al microscopio) = test positivo: emazie non compatibili per probabile presenza di anticorpi irregolari.
Assenza di agglutinazione = test negativo: emazie compatibili (assenza di anticorpi irregolari)

In caso di positività ed utilizzo di siero di Coombs polispecifico (anti IgG ed anti-C3d) è necessario confermare la natura “anticorpale” della reazione ed escludere una interferenza aspecifica da parte del complemento presente nel siero. Il complemento eventualmente presente sui globuli rossi può essere conseguenza di una attivazione immune da parte di anticorpi anti-eritrocitari ma anche conseguenza di una attivazione aspecifica causata da altre situazioni patologiche in corso.
Nel caso che venga utilizzato siero fresco (nel plasma anticoagulato il complemento è inattivato) la presenza di emolisi evidente dopo l’incubazione - con presenza di siero rosato –deve essere interpretata come risultato positivo, cioè emazie non compatibili. Gli anticorpi anti-eritrocitari in presenza di complemento fresco e dei corrispettivi antigeni eritrocitari possono infatti lisare i globuli rossi.

Se il test è negativo dovrebbe essere aggiunta alla provetta del test una goccia di sospensione di emazie ricoperte di anticorpi come controllo positivo e si ricentrifuga la provetta. Se il siero di Coombs è effettivamente attivo dopo la centrifugazione si osserverà la agglutinazione delle emazie di controllo.


[1] Per preparare emazie ricoperte di IgG è sufficiente incubare delle emazie Rh-D positive a 37°C con un antisiero policlonale anti-D. L’antisiero policlonale contiene anche IgG , bisogna perciò verificare se questa caratteristica è presente nel prodotto commerciale che si utilizza. Dopo l’incubazione le emazie poi vanno lavate e risospese in fisiologica al 3-4%. Così preparate possono essere utilizzate come controllo positivo per il siero di Coombs e sono stabili in frigorifero per alcuni giorni.
[2] Il tempo di incubazione del test di Coombs indiretto può essere ridotto a 15 minuti con l’utilizzo al posto della soluzione fisiologica di soluzioni a bassa forza ionica (LISS = low ionic strength solution) che potenziano la reazione antigene-anticorpo. Le soluzioni LISS sono disponibili in commercio.