sabato 28 marzo 2009

Le reazioni di agglutinazione dei globuli rossi: domande e risposte

Cos’è ed a cosa serve la reazione di agglutinazione dei globuli rossi?
L’agglutinazione dei globuli rossi è un test di laboratorio semplice economico e sensibile che permette di evidenziare il legame tra anticorpi diretti contro degli antigeni eritrocitari ed i globuli rossi che presentano gli antigeni in causa.(...)
 Le reazioni di agglutinazione quindi sono essenziali in immunoematologia per i seguenti scopi:
conoscere gli antigeni presenti sui globuli rossi : la cosiddetta tipizzazione eritrocitaria. Per questo si utilizzano antisieri specifici (cioè soluzioni di anticorpi specifici) disponibili in commercio contro antigeni noti (qad es. anti-A e anti-B).
Ricercare la presenza di anticorpi anti-emazie nel paziente che deve ricevere una trasfusione di sangue con lo scopo di prevenire gravi reazioni emolitiche trasfusionali.

Gli anticorpi agglutinano sempre le emazie che presentano l’antigene bersaglio?
Perché i gli anticorpi “agglutinino” le emazie sulle quali sono presenti gli antigeni bersaglio è necessario che si realizzino le condizioni per cui avvenga
il legame dell’anticorpo con l’antigene (tra le quali la temperatura ed il tempo di incubazione ottimali)
la creazione di ponti tra i globuli rossi ovvero gli anticorpi sono riescono a legare antigeni presenti su globuli rossi diversi.
Queste due condizioni non si realizzano sempre e con facilità, per questo motivo è necessario ricorrere all’ausilio di ulteriori reattivi, quali il siero antiglbulina umana ( o siero di Coombs’) per mettere in evidenza con l’agglutinazione l’avvenuto legame antigene-anticorpo.

Come si evidenzia l’agglutinazione?

Tradizionalmente le agglutinazioni in immunoematologia vengono messe in evidenza cimentando una soluzione contenente anticorpi (un siero/plasma umano o un antisiero commerciale) con una sospensione di globuli rossi. Questo può essere fatto mescolando la sospensione delle emazie in soluzione fisiologica e il siero da testare su di un vetrino, attendendo la eventuale agglutinazione. Per accelerare e facilitare il fenomeno dell’agglutinazione si utilizza spesso la tecnica in tubetto od in micropiastra: in questo caso la miscela viene centrifugata di modo che le emazie vengano ben sedimentate nel fondello della provetta o dei pozzetti. In questa maniera si accelera la formazione di ponti tra i globuli rossi da parte degli anticorpi. L’eventuale agglutinazione viene messa in evidenza cercando di risopendere le emazie con dei colpetti e delle rotazioni od utilizzando dei vortex: questo riuscirà completamente se non vi è stata agglutinazione. Se invece le emazie non verranno sospese perfettamente nella soluzione ma resteranno adese in agglomerati visibili significa che vi è stata agglutinazione.

Che aspetto ha l’agglutinazione?

Gli agglutinati potranno essere di dimensioni diverse, da facilmente rilevabili ad occhio nudo, in provetta o su vetrino, a visibili solo al microscopio a piccolo ingrandimento. Le dimensioni degli agglutinati dipenderanno dal numero di legami che gli anticorpi riescono a stabilire tra diverse cellule. Nel caso delle agglutinazioni per la determinazione del gruppo AB0 la agglutinazione sarà pressoché sempre evidente ad occhio nudo, dato il grande numero degli antigeni A e B presenti sulla membrana del globulo rosso e le dimensioni degli anticorpi (di classe IgM) che riescono facilmente a fare “ponte” tra due globuli rossi.
All’osservazione microscopica i globuli rossi veramente agglutinati appaiono come un agglomerato di cellule dai margini irregolari. Le cellule coinvolte, poche o molte che siano, appaiono strettamente e disordinatamente legate tra loro. Le membrane degli eritrociti agglutinati appaiono al microscopio quasi fuse insieme
Oggi per evidenziare l’ agglutinazione si utilizzano spesso delle schedine con micro colonne di gel o di microsfere che permettono di rilevare in maniera facile e persistente la avvenuta agglutinazione. Il principio di questa metodica è quello di fare avvenire la eventuale reazione di agglutinazione della sospensione con le emazie ed il “siero” od il plasma in esame nel pozzetto sopra la colonna di gel. La schedina viene poi centrifugata utilizzando apposite centrifughe: se vi sono delle cellule agglutinate queste rimarranno intrappolate nella colonnina di gel mentre quelle libere sedimenteranno sul fondo.

Che significato ha quantificare la agglutinazione osservata?
Qualunque sia il metodo usato per evidenziare la avvenuta agglutinazione a seconda della dimensione degli agglutinati osservati è possibile dare un valore quantitativo alla reazione, il cosiddetto grading. Da un punto di vista pratico e per il significato clinico che gli compete anche la reazione più debole, se confermata, deve essere considerata come positiva a tutti gli effetti: significa cioè che sono verosimilmente presenti degli anticorpi diretti contro gli antigeni dei globuli rossi esaminati e che questi possono avere una azione emolitica.
Tuttavia anche le agglutinazioni aspecifiche non dovute ad anticorpi e le false agglutinazioni si manifestano con fenomeni inizialmente non distinguibili da deboli (ma vere) agglutinazioni: per questo una debole agglutinazione di dubbio significato o incongruente significato in sede di interpretazione richiede ulteriori approfondimenti il primo dei quali spesso è la ripetizione del test per conferma.
Nella pratica di laboratorio il “grading” della agglutinazione è utile nelle seguenti circostanze:
1.Quando si utilizza un pannello di globuli rossi per la identificazione degli anticorpi i diversi gradi di agglutinazione osservati possono aiutare ad identificare la specificità di un anticorpo con due meccanismi :
§ la possibile reattività diversa tra espressione eterozigote ed omozigote di un antigene (il cosiddetto effetto dose)
§ la presenza di miscele di anticorpi diversi che si manifestano con diversa “avidità” o con effetto additivo.
2. In corso di tipizzazione con antisieri anti-A o anti-B, quando attendiamo reazioni molto forti, la presenza di reazioni deboli può indicare la presenza di sottogruppi minori (es. A3) od altre alterazioni acquisite dai globuli rossi. (figura : grading)

Cosa può essere confuso con una agglutinazione?

La agglutinazione và distinta da altri fenomeni peraltro non molto frequenti di aggregazione in vitro tra emazie meno ma che possono essere confusi con essa se osservati ad occhio nudo.
L’esperienza, un’osservazione attenta e, soprattutto, l’osservazione microscopica della sospensione cellulare permette di dirimere i dubbi.
Questi fenomeni sono:
l’impilamento (formazione di ruleaux): la emazie al microscopio appaiono impilate come una colonna di piatti; questo fenomeno è dovuto in genere ad una alta concentrazione di immunoglobuline (come nel caso di pazienti con mieloma). Gli impilamenti possono essere facilmente dispersi nelle metodiche in tubetto con l’aggiunta di alcune gocce di soluzione fisiologica che diminuiscono la concentrazione proteica. Questo fenomeno che si presenta come pseudo agglutinazione può essere osservato anche nelle metodiche in schedina (micro colonne).
La presenza di materiale amorfo (polvere od altro): in genere il materiale amorfo è riconoscibile ed una osservazione attenta e con l’ausilio del microscopio. Per evitare questi artefatti bisogna scrupolosamente garantire la pulizia dei vetrini, delle provette e delle superfici di lavoro.
La presenza di coaguli : se il siero od il plasma utilizzati non sono perfettamente privi di attività coagulante è possibile la formazione di coaguli durante le prove di compatibilità. I coaguli, inglobando i globuli rossi possono apparire microscopicamente simili ad agglutinati ma si distinguono in quanto hanno dei bordi lisci e non irregolari come questi ultimi. Nel caso dei test eseguiti con le colonne di gel o di microsfere i coaguli non penetrano nel gel e possono essere facilmente rimossi con la punta di un ago.
Le comete: fenomeno osservato in passato quando si utilizzavano soluzioni di ad alta concentrazione di albumina come potenziante. In queste condizioni i globuli rossi possono aggregarsi in maniera spontanea ma blanda in formazioni a margini lisci: con il movimento del campo questi si frantumano lasciando una coda di emazie libere

I fenomeni di aggregazione aspecifica o pseudo agglutinazione elencati sopra sono stati descritti in dettaglio per le metodiche tradizionali (vetrino e provetta). Possono essere tuttavia osservati anche nelle metodiche in micro-colonna, con la importante differenza che non è possibile ricorrere all’esame microscopico di conferma.

Anticorpi anti-eritrocitari presenti possono rendersi evidenti in vitro in maniera diversa dalla agglutinazione?
Se si utilizza del siero fresco la azione degli eventuali anticorpi anti-eritrocitari presenti può dare luogo ad una emolisi provocata dal complemento attivato dalla reazione antigene-anticorpo stessa. La gran parte degli anticorpi non sono in grado di fissare il complemento in maniera significativa, altri riescono a fissare le prime fasi della catena complementare evidenziata con la persistenza di frammenti quali il C3dg sulle emazie. Alcuni tuttavia sono in grado di attivare l’intera cascata complementare fino alla lisi del globulo rosso. Per ottenere una eventuale attivazione del complemento bisogna utilizzare campioni di siero fresco in cui l’attività complementare sia mantenuta. In questo caso dopo la incubazione a 37°C (temperatura alla quale si attiva il complemento) delle emazie con il siero e dopo centrifugazione la eventuale presenza di emoglobina libera, evidente con il colore da rosato a rosso scuro del siero sopranatante, devono fare sospettare una reazione positiva e quindi una incompatibilità anche in assenza di agglutinazione. Per una serie di motivi pratici (tra i quali la necessità di avere campioni freschi) in molti centri non si ritiene più indispensabile rivelare l’azione emolitica. Inoltre la ricerca della attivazione complementate utilizzando il siero di Coombs polispecifico (con anti-C3d oltre ad anti-IgG) può dare false positività legate alla attivazione aspecifica del C sulla superficie dei globuli rossi od alla azione di anticorpi freddi (es. autoanti-I) non clinicamente significativi . In altre parole la sola agglutinazione è considerata da molti sufficiente è più specifica ad evidenziare la reazione antigene-anticorpo. Per questo motivo molti centri oggi utilizzano plasma o siero “scomplementato”, cioè non fresco, nelle prove di compatibilità. Ciò detto nella eventualità che si utilizzi siero fresco la presenza di emolisi dopo la incubazione con globuli rossi test và interpretata come reazione positiva: l’emolisi completa dei globuli rossi potrebbe infatti portare ad una paradossale “non agglutinazione” semplicemente perché i globuli rossi a seguito della lisi stimolata dalla reazione antigene-anticorpi non ci sono più.

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