2. Fattori che influenzano la fase di agglutinazione vera e propria

Fattori che intervengono nella fase di Agglutinazione

La agglutinazione immune vera e propria rappresenta solo il secondo momento della "reazione di agglutinazione", essendo la prima rappresentata dalla sensibilizzazione, ovvero la formazione del legame antigene-anticorpo (....)
Le due fasi avvengono in momenti diversi anche se in certi frangenti (es. con anticorpi IgM) in successione molto rapida e quasi "immediata". La agglutinazione è causata dalla formazione ponti tra i globuli rossi con la produzione di un agglomerato più o meno grande di emazie di consistenza simil-gelatinosa. La fase di agglutinazione è a sua volta influenzata da diversi fattori alcuni dei quali sono legati alla natura dell’antigene e dell’anticorpo (numero dimensioni) altre legate alle caratteristiche della superficie dei globuli rossi ed al bilancio delle forze di attrazione e di repulsione, e quindi la distanza minima raggiungibile tra gli stessi.

• Il numero e localizzazione dei siti antigenici: maggiore il numero di siti antigenici maggiore è il numero di che si possono creare ponti tra le emazie. Gli antigeni più esposti sulla membrana, quali quelli delle glicoproteine, possono facilmente essere “cross-linked” anche dalle IgG a differenza di quelli localizzati nello spessore della membrana cellulare.
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  Dimensioni e struttura dell’anticorpo: gli anticorpi dalle dimensioni più grandi, quali le IgM , creano ponti tra i globuli rossi con più facilità. Inoltre ed ovviamente anche il maggior numero di siti leganti facilitano l’agglutinazione tra più emazie: le IgM sono costituite da 5 unità ed esprimono quindi dieci siti leganti e per questo motivi possono creare agglutinazioni macroscopiche con grande facilità.
• Il rapporto – Ratio- tra Antigene-Anticorpo: la creazione di ponti tra le emazie da parte degli anticorpi in soluzione è ottimale quando vi sono circa 80 parti di anticorpi per una parte di antigene. L’eccesso di anticorpo od antigene rispetto a questo rapporto fa si che il legame tra questi, pur avvenendo , non dia luogo ad una agglutinazione altrettanto evidenziabile. Si parla pertanto di: Prozona quando l’eccesso di anticorpo satura i siti antigenici riducendo così la formazione di ponti tra cellule diversePostzona: quando l’eccesso di antigene fa si che le agglutinazioni siano poche e non evidenziabili.In immunoematologia per raggiungere un rapporto ottimale di reazione tra gli anticorpi presenti nel plasma o negli antisieri in commercio si usano sospensioni di globuli rossi al 3% per la metodica in provetta ed allo 0,5% per quella in micro colonne. Tuttavia l’effetto prozona fortunatamente non è rilevante in immunoematologia e un eccesso di anticorpo di solito non risulta in una mancata agglutinazione.
• La distanza tra le cellule: la creazione di ponti da parte degli anticorpi è possibile solo se i globuli rossi sono abbastanza vicini. Nelle metodiche in tubetto od in micro colonna si utilizza la centrifugazione delle sospensioni di globuli rossi per compattare le cellule e facilitare ed accelerare la formazione di agglutinati. I globuli rossi tenderebbero ad aggregarsi spontaneamente in virtù delle forze di tensione di superficie, questa tendenza è contrastata dalla forza di repulsione esercitata dalle cariche elettrostatiche che circondano le emazie. Gli acidi sialici che ricoprono la superficie degli eritrociti infatti caricano negativamente i globuli rossi quindi tendono a respingersi, questa forza elettrostatica di repulsione è chiamato potenziale Z. I cationi (ioni positivi) presenti in soluzione tendono a disporsi intorno alle cariche negative neutralizzando e riducendo inparte la forza negativa di repulsione (potenziale Z) e quindi la distanza minima raggiungibile dai globuli rossi tra di loro. In soluzione fisiologica (0,9% NaCl) il potenziale Z è -18mV, che corrisponde ad una distanza di 18-20 nm. A questa distanza solo le IgM , più grandi) riescono a “fare ponte”, per le IgG invece è necessario che la distanza sia ridotta sotto i 13 nm, e cioè che il potenziale Z sia inferiore ai 13mV[1].

Il potenziale Z può essere influenzato in tre maniere:

Variando la forza ionica: aumentare gli ioni presenti in soluzione avrebbe l’effetto di abbassare il potenziale Z ma come detto l’aumento della forza ionica avrebbe l’effetto paradosso di diminuire il legame Ag-Ac: per questo si preferisce comunque utilizzare le soluzioni LISS a bassa forza ionica.

Variando la costante diaelettrica del mezzo mediante macromolecole solubuli quali albumina, oppure utilizzando polimeri policationici quali il polibrene e solfato di protamina. Con il polibrene le forze di repulsione sono quasi annullate e le emazie agglutinano spontaneamente permettendo così, data la distanza ridotta, la formazione di legami da parte anche di IgG. l’aggiunta successiva di sali neutri quali il sodio citrato annulla l’effetto “agglutinante” del polibrene: la persistenza della agglutinazione indica quindi la presenza di anticorpi “cross linked”.
Modificando la carica elettrica superficiale dei globuli rossi: l’utilizzo di enzimi proteolitici (ficina, bromelina, papaina, tripsina) permette di rimuovere le proteine cui sono legati gli acidi sialici. Il trattamento proteolitico inoltre è in grado da un lato di rendere più accessibili alcuni antigeni (es. Rh ). Alcuni antigeni vengono però distrutti dal trattamento proteolitico (es. antigeni M,N,S, e sistema Duffy) e per questo il metodi enzimatico non è indicato per lo screening degli anticorpi.


Conclusioni:
Gli anticorpi di glasse IgM presenti nel siero o nel plasma in virtù delle loro caratteristiche sono in genere capaci di legare direttamente e rapidamente già a temperatura ambiente le emazie sospese in soluzione fisiologica che presentano l’antigene bersaglio.
Al contrario la reazione tra un anticorpo di classe IgG diretto contro un antigene eritrocitario raramente dà origine ad una agglutinazione diretta. Vi sono vari modi per “potenziare” la capacità delle immunoglobuline di classe G – IgG .- di agglutinare le emazie. Quello più utilizzato, affidabile e riproducibile è l’utilizzo del siero antiglobulina – o siero di Coombs’ – che è capace di legare le IgG umane che si sono adese dopo una fase di adeguata incubazione al 37°C agli antigeni presenti sulla superficie dei globuli rossi. Il legame tra gli anticorpi anti IgG umane e le immunoglobuline presenti sulla superficie dei globuli rossi creerà così dei ponti tra le emazie dando luogo al fenomeno della agglutinazione.

[1] Con l’aumentare del numero di lagami Ag-Ac diminuisce anche la carica di superficie e quindi anche il potenziale Z può diminuire fino al 25%. Per questo anche le IgG possono in certe circostanze, e cioè in presenza di un alto numero di legami sulla superficie del globulo rosso, agglutinare direttamente i globuli rossi.